简历陈生弟 ,教授、主任医师、医学博士、博士生导师 ;现任上海第二医科大学附属瑞金医院党委副书记、神经内科主任 ,神经病学研究所所长 ;国际神经病学联盟帕金森病研究委员会委员、国际运动障碍疾病学会及美国神经科学学会会员、中华医学会神经病学分会委员、运动障碍疾病学组组长、上海医学会神经内科及老年医学专业委员会副主任委员等职 ;担任《中华神经科杂志》等 23本杂志的副主编、常务编委或编委 ;在帕金森病和阿尔茨海默病的临床与基础研究中取得一系列成果 ,主持或参加国家和部级科研基金项目 32项 ;获得国家和部级科技进步奖 14项 ;在国内外发表论文、述评和综述 214篇 ;主编、主译 4部和参编 22部著作 ;获得国家有突出贡献中青年专家、全国中青年医学科技之星、上海市卫生系统“银蛇奖”二等奖 ,19 9 3年起享受国务院政府特殊津贴。

　　摘要

　　目的 :探讨中药制剂通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗和保护机制。方法 :选用大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型 ,随机分为生理盐水对照组、通心络治疗组和预防组 ;分别在缺血 2小时再灌注后 1小时、1天及 5天测定脑组织含水量 ,ＴＴＣ染色观测脑梗死面积 ,透射电镜观察海马神经元的超微结构变化 ,ＴＢＡ法和比色法测定梗死侧大脑皮层匀浆ＳＯＤ、ＧＳＨ -ＰＸ、ＭＤＡ、ＮＯ含量 ,比色法观察钠 -钾 -ＡＴＰ(Ｎｚ+-Ｋ+-ＡＴＰ)酶活性 ,免疫荧先测定小胶质细胞活化 ,ｗｅｓｔｅｒｎ -ｂｌｏｔ和ＲＴ -ＰＣＲ分别检测ｃａｓｐａｓｅ - 3和ｃ -ｆｏｓ的表达。结果 :与对照组比较 ,通心络治疗组和预防组的大脑梗死面积明显减少 ,脑梗死侧含水量减低 ,ＳＯＤ、ＧＳＨ -ＰＸ和Ｎａ+-Ｋ+-ＡＴＰ ,酶含量增加 ,ＭＤＡ、ＮＯ含量降低 ;小胶质细胞活化减少 ,ｃａｓｐａｓｅ - 3和ｃ -ｆｏｓ表达下降 ,以及细胞凋亡明显减轻。结论 :通心络通过调节自由基、钙平衡、炎性反应、凋亡等多途径 ,从而减轻大鼠缺血再灌注损伤 ,通心络是治疗和预防缺血性卒中较有效的神经保护剂。

　　脑梗死急性期 ,尤其是缺血后血液再灌注时 ,其损伤机制十分复杂。目前认为缺血后产生的一系列生化反应 ,即缺血级联反应对缺血区域的神经元命运起重要作用。脑组织中脂质过氧化 (ＬＰＯ )水平增高 ,氧自由基不但引起神经元、胶质细胞生物膜和亚细胞结构及功能破坏 ,且引起血管内皮细胞膜过氧化 ,导致血管壁通透性改变和缺血损伤加重。在脑梗死的急性期 ,神经细胞的损伤既有坏死 ,又有凋亡。细胞坏死位于缺血中心区 ,细胞凋亡位于缺血半暗带区。脑梗死的迟发性神经元死亡以凋亡为主。

　　通心络胶囊是由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成的中药复方制剂 ,有益气活血、通络止痛等功效。本研究通过在体实验 ,运用形态学、分子生物学和免疫组化等方法 ,研究通心络对脑缺血再灌注损伤的治疗和保护作用机制 ,为临床通心络胶囊治疗脑缺血提供实验依据。

　　材料与方法

　　动物与分组 :成年雄性ＳＤ大鼠 9 9只 ,体重 ( 250～ 280)ｇ(购自上海ＢＫ实验动物有限公司 ) ,常规环境饲养。先建立局灶性脑缺血再灌注模型 (方法见下 ) ,然后随机分为生理盐水对照组 (下称对照组 ,ｎ =33) ,通心络治疗组 (下称治疗组 ,ｎ =33) ,通心络预防组 (下称预防组 ,ｎ =33)。各组再分 3小组 ,分别在缺血再灌注后 1ｈ、1ｄ、5ｄ处死动物。

　　局灶性脑缺血再灌注模型的建立 :参照改良的Ｌｏｎｇａ方法 (线栓法 ) ,制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。首先以戊巴比妥钠 50ｍｇ/ｋｇ腹腔内注射麻醉 ,取颈正中切口 ,依次暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉 ,结扎颈外动脉远端及翼腭突动脉 ,在颈外动脉远心端分支处插入 4～ 0聚丙烯手术缝线 [线端预先加热成球形 ,直径 ( 0.3 0～ 0.35)ｍｍ ] ,缓慢向颈内动脉推进插线。当进线 ( 17～ 20)ｍｍ时 ,可感到明显的阻力 ,同时可见颈内动脉颅外段明显的屈曲、紧张 ,提示尼龙线已阻塞大脑中动脉。用缝线在颈外动脉处结扎固定尼龙线并结扎切口。缺血 2ｈ后拔除尼龙线 ,造成缺血再灌注损伤。分别于再灌注后不同时间处死大鼠 ,取样作检测。

　　给药方法 :在造模后即刻及观察期每日给予治疗组大鼠腹腔注射 2ｍｌ通心络 ( 0.5 ｇ/ｋｇ) ;给予预防组大鼠在造模前的前 5天起连续每日腹腔注射 2ｍｌ通心络 ( 0.5ｇ/ｋｇ) ;在造模后即刻及观察期每日给予对照组大鼠腹腔注射 2ｍｌ生理盐水。神经功能缺损评分从略。

　　脑组织含水量测定 :在各观察时间点将实验动物断头取脑 ,左右大脑半球分开 ,分别经电子分析天平 (分度值 0.1ｍｇ)精确称重后 ,放入 100℃恒温干燥箱烘烤 24ｈ至恒重后 ,再精确称干脑组织重量 ,并按Ｅｌｌｉｏｔ干湿重法计算脑皮质含水量 ,以百分率表示。含水量 =(湿重 -干重 ) /湿重× 100%。

　　ＴＴＣ染色 :实验大鼠在规定时间断头取脑 ,由前至后每隔 2ｍｍ厚度做冠状面切开 ,浸于 2%ＴＴＣ中 30ｍｉｎ ,ＴＴＣ被脑组织线粒体内过氧化氢酶还原 ,可使正常脑组织染成深红色 ,梗死灶为白色。按顺序依次由前向后用扫描仪将图像信息输入计算机 ,用Ｎｉｋｏｎ＆Ｓｐｏｔ图像采集分析系统分别测定脑梗死面积 ,输入片厚参数 ,计算出梗死体积。

　　透射电镜观察海马神经元超微结构变化 :各组动物快速断头取脑 ,标本用 2.5%戊二醛固定 ,经处理后用透射电镜观察。

　　组织匀浆指标测定 :将各组动物断头取脑 ,用生理盐水冲洗 ,取病变侧脑组织称重 ,与匀浆缓冲液 1: 9体积放于匀浆器中研磨均匀 ,4 000转 /ｍｉｎ离心 10ｍｉｎ ,制成10%脑组织匀浆。取上清夜 - 20℃保存待测。采用羟胺法测定超氧化物歧化酶(ＳＯＤ )含量 ,ＴＢＡ法测定丙二醛 (ＭＤＡ )含量 ,比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶 (ＧＳＨ-ＰＸ )、一氧化氮 (ＮＯ )和Ｎａ+-Ｋ+-ＡＴＰ醇含量。检测方法和结果计算均按南京建成生物医学工程研究所提供的试剂盒说明书进行。

　　免疫荧光观察小胶质细胞 :将各组动物断头取脑 , - 70℃保存。标本做冰冻 ( -20℃ )切片 ,片厚 5μｍ。常规处理后 ,加抗ＧＦＡＰ抗体 ( 1: 1000,ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司 ) ,37℃孵育 1ｈ ,ＰＢＳ洗涤 3次。加ＦＩＴＣ标记的鼠抗羊ＩｇＧ(购自华美生物工程公司 )检测 ,甘油 -ＰＢＳ液封片 ,荧光显微镜观察。

　　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测脑ｃａｓｐａｓｅ - 3表达 :脑组织蛋白的提取和分离 :取海马组织15 0ｍｇ加 1×ＳＤＳ蛋白提取液 ( 50ｍｇ/ｍｌ组织 )磨研至混浊 ,离心后取上清。 160ｇ蛋白和上样缓冲液混匀后加至 12%ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶上样孔中。电泳 :先 20ｍｉｎ ,100ｖ ,然后 2ｈ ,150ｖ ,最后转至硝酸纤维膜上。

　　ＲＴ -ＰＣＲ检测脑ｃ -ｆｏｓ基因表达 :Ｃ -ｆｏｓ探针 5′ -ＡＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡ - 3′ ;5′ -ＡＴＧＡＴＧＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧ - 3′(由上海生工合成 )。ｂ -ａｃｔｉｎ为内参照。ｂ -ａｃｔｉｎ序列为 5′ -ＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＣＧＡＣ - 3′和 5′ -ＡＡＴＣＡＡＣＧＣＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡ - 3′。反应物用ＳＤＳ -ＰＡＧＥ电泳 ,经紫外扫描仪对ｃ-ｆｏｓ进行半定量分析。

　　统计学分析 :所有数据采用ＳＡＳ软件进行统计分析 ,Ｐ <0.05具有统计学意义。

　　结果

　　形态学变化

　　脑含水量测定结果 :大鼠缺血 2ｈ再灌注后 ,从 1天到 5天 ,通心络干预组 (治疗组和预防组 ) ,其脑梗死侧和非梗死侧含水量均明显低于未用药对照组 ,差异具有统计学意义。

　　通心络对脑梗死体积的影响 :大鼠缺血 2ｈ再灌注后 ,从 1天到 5天 ,通心络干预组大鼠的脑梗死体积明显小于未用药对照组 ,差异具有统计学意义。

　　透射电镜观察海马神经元的超微结构 :缺血再灌注组大鼠细胞核的核膜不完整、核仁溶解消失、染色质固缩边聚 ,细胞浆中核糖体减少、高尔基体散在、粗面内质网肿胀、线粒体肿胀或空泡化。治疗组与预防组较对照组细胞坏死肿胀明显减轻。

　　通心络对大鼠梗死侧皮层匀浆ＳＯＤ、ＧＳＨ -ＰＸ、ＭＤＡ、ＮＯ含量的影响 :大鼠缺血2ｈ再灌注后 ,从 1ｈ、1天到 5天 ,预防组大鼠梗死侧皮层匀浆ＳＯＤ、ＧＳＨ -ＰＸ含量明显高于未用药对照组 ,差异具有统计学意义 ,而治疗组的ＳＯＤ、ＧＳＨ -ＰＸ含量较对照组无显著差异。

　　(未完待续 )